绿色荧光蛋白基因的重组背景知识绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）是一类存在于包括水母、水和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。GFP由3个外显子组成，长2.6kb：GFP是由238个氨基酸所组成的单体蛋白，相对分子质量为27.0kD，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420nm，宽240nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位手大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成。实验目的学习DNA的酶切、电泳、胶回收纯化、连接、细菌转化和PCR等分子生物学的基本操作方法了解基因重组的一般程序。实验原理将携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的真核表达载体pEGFP-N3质粒进行BamHI和NotI双酶切，切割下EGFP基因，同时对原核表达空载体pET32a也进行同样的双酶切产生互补的粘性末端，对切割下的EGFP基因片段和pET32a片段分别进行电泳和切胶纯化后，再进行连接（定向克隆）产生pET32aEGFP重组质粒。以重组质粒转化大肠杆菌克隆菌株DH5α，抗生素筛选后再以菌落PCR法筛选到阳性克隆
1 绿色荧光蛋白基因的重组 背景知识 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括 水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光 激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其 蛋白质一级序列固有的。GFP 由 3 个外显子组成，长 2.6kb；GFP 是 由 238 个氨基酸所组成的单体蛋白，相对分子质量为 27. 0 kD，其蛋白 性质十分稳定，能耐受 60℃处理。1996 年 GFP 的晶体结构被解出， 蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长 420 nm，宽 240 nm，由 11 个 围绕中心 α 螺旋的反平行 β 折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺 旋开始的，桶的顶部由 3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直 片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其 蛋白质内部第 65-67 位的 Ser-Tyr-Gly 自身环化和氧化形成。 实验目的 学习 DNA 的酶切、电泳、胶回收纯化、连接、细菌转化和 PCR 等分子生物学的基本操作方法， 了解基因重组的一般程序。 实验原理 将携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的真核表达载体 pEGFP-N3 质粒进行 BamHI 和 NotI 双酶切，切割下 EGFP 基因，同时对原核表达空载体 pET32a 也进行同样的双酶切产生互补的粘性末 端，对切割下的 EGFP 基因片段和 pET32a 片段分别进行电泳和切胶纯化后，再进行连接（定向克 隆）产生 pET32a_EGFP 重组质粒。以重组质粒转化大肠杆菌克隆菌株 DH5α，抗生素筛选后再以菌 落 PCR 法筛选到阳性克隆
1.pEGFP-N3质粒全图谱Asel(8)SnaBIApaLI(341)(4358)MCS(591665)PCMV IEpUCEc001091ori(3852)/HSVTKEGFPpolyApEGFP-N3BsrG I (1385)4.7 kbSV40NotI (1398)Kan'polyAXba |* (1408)Neorf1SV40oriporiPsV40AflIl(1636)Dra III (1870)Stul(2575)591611621631641651661601671EGFPGCTAGC GCTACC GGA CTC AGA TCT CGAGCT CAA GCTTCG AAT TCT GCA GTC GAC GGTACC GCG GGC CCG GGA TCC ATC GCC ACC ATG GTGNhel Eco47 IlIHind IlApalBamHIBglllXholEcoRIPstlSallKpnIXcmlSaclBsp120lXmalAcc1Asp7181Ec/136 1ISacllSmaipEGFP-N3质粒全图谱及多克隆位点实验使用的EGFP基因取自原核-真核穿梭质粒pEGFP-N3的蛋白质编码序列。此质粒原本被设计于在原核系统中进行扩增，并可在真核哺乳动物细胞中进行表达。本质粒主要包括位于PcMV（巨细胞病毒启动子）真核启动子与SV40（猿猴病毒40）真核多聚腺苷酸尾部之间的EGFP编码序列与位于EGFP上游的多克隆位点；一个由SV40早期启动子启动的卡那霉素/新霉素抗性基因，以及上游的细菌启动子可启动在原核系统中的复制与卡那抗性。在EGFP编码序列上下游，存在特异的BamHI及NotI限制性内切酶位点，可切下整段EGFP编码序列。2
2 1．pEGFP-N3 质粒全图谱 pEGFP-N3 质粒全图谱及多克隆位点 实验使用的EGFP基因取自原核-真核穿梭质粒pEGFP-N3的蛋白质编码序列。此质粒原本被设 计于在原核系统中进行扩增，并可在真核哺乳动物细胞中进行表达。本质粒主要包括位于PCMV（巨 细胞病毒启动子）真核启动子与SV40（猿猴病毒40）真核多聚腺苷酸尾部之间的EGFP编码序列与 位于EGFP上游的多克隆位点；一个由SV40 早期启动子启动的卡那霉素/新霉素抗性基因，以及上 游的细菌启动子可启动在原核系统中的复制与卡那抗性。在EGFP编码序列上下游，存在特异的 BamH I及Not I限制性内切酶位点，可切下整段EGFP编码序列
al(158)Xho(158)Eag.(166)Not(166ind Il(173)Sal i(179)2.pET32a质粒全图谱Sac l(190)Bpu1102 (a0)EcoRI(192)BamH(198)EcoR.V(206)Nco l(212)Bgl I(241)Kpnl(238)Dra I(5658)MS1291260Rsrl(589)1 orgin(5434-5889)trxAXba (729)(366SgrA I(840)Sca l(4995)OOSph (996)Pvu I(4885)=5EcoN I(1056)6Pst I(4760)bb)ApaB (1205)12Bsa (4576)Eam1105(4357)lacl(1171),Mlu (1521)pET-32a(+)Bcl (1535)(5900bp)BstE I(1702)Bmg(1730)1Apal(1732)AlwN I(4038)BssH Il(1932)Hpa l(2027)BspLU11(3622)PshA I(2366)Sapl(3506)Bst1107(3393)Psp51(2628)Tth111(3367)BspG I(3148)T7promoterlac operatorXbalrbsMTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATrx-TagHis-TagMsclTATACATATGAGC.315bP..CTGGCCGGTTCTGGTTCTGGCCATATGCACCATCATCATCATCATTCTTCTGGTCTGGTGCCACGCGGTTCTMetSer105aa..LeuAlaGlySerGlySerGlyHisMetHisHIsHisHiSHisHisSerSerGlyLeuValProArgGlySens-Tagprimer#69945-3S·TagthrombinNspVBalllKpniGGTATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGCCCAGATCTGGGTACCGACGACGACGACAAGGlyMetLysGluThrAlaAlaAlaLysPheGluArgGInHisMetAspSerProAspLeuGlyThrAspAspAspAspLysTenterokinasepET-32a(+)Ava!1EcoRVBamHIEcoRI SaclSalIHindIlHis·TagNcolXhoGCCATGGCTGATATCGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAAAlaMetAlaAsplleGlySerGluPheGluLeuArgArgGlnAlaCysGlyArgThrArgAlaProProProProProLeuArgSerGlyCysEndGCCATGGCGATATCGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAApET-32b(+)AlaMetAlalleSerAspProAsnSerSerSerValAspLysLeuAlaAlaAlaLeuGluHisHisHisHisHisHisEndGCCATGGGATATCTGTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAAPET-32C(+)AlaMetGlyTyrLeuTrplleArglleArgAlaProSerThrSerLeuArgProHIsSerSerThrThrThrThrThrThrGlulleArqLeuLeuThrT7terminatorBpu11021CAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGLysProGluArgLysLeuSerTrpLeuLeuProProLeuSerAsnAsnEndT7terminatorprimer#69337-3pET-32a-c(+)cloning/expressionregion表达EGFP蛋白使用的pET32a原核表达载体包含有在多克隆位点两侧的His-tagpoly(His）编码序列：用于表达蛋白的T7启动子以及T7终止子：编码lac阻遏蛋白的lacI编码序列，选择性筛选使用的氨苄青霉素（Amp）抗性序列，pBR322启动子，以及为产生单链DNA产物的f1启动子。3
3 2．pET32a质粒全图谱 表达EGFP 蛋白使用的pET32a原核表达载体包含有在多克隆位点两侧的His-tag poly(His) 编码 序列；用于表达蛋白的T7启动子以及T7 终止子；编码lac阻遏蛋白的lacI编码序列，选择性筛选使 用的氨苄青霉素（Amp）抗性序列，pBR322 启动子，以及为产生单链DNA产物的f1 启动子
准备（周一，约半天）实验一DNA重组（周二，1天）一、实验目的学习使用限制性内切酶及DNA连接酶进行DNA酶切、重组的原理和方法，同时学习琼脂糖凝胶电泳检测和纯化DNA的方法和技术。二、实验原理迄今已发现了3000多种限制性内切酶。传统上将限制性内切酶按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素划分为三大类。II型酶在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链。它们产生确定的限制片段，因此是三类限制性内切酶中唯一用于DNA分析和克隆的一类。II型限制性内切酶中最普遍的如EcoRI、HindIII、BamHI和NotI这样在识别序列中进行切割的酶。这一类酶是构成商业化酶的主要部分。大部分这类酶都以同二聚体的形式结合到DNA上，因而识别的是对称序列：但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列。一些酶识别连续的序列（如EcoRI识别GAATTC：HindIII识别AAGCTT，BamHI识别GIGATCC；NotI识别GCIGGCCGC）：而另一些识别不连续的序列（如BglI识别GCCNNNNNGGC）。限制性内切酶酶切DNA后形成两种类型的末端：(i）两条链断裂的位置是交错地，产生粘性末端，如EcoRI酶切后产生末端；（i）两条链的断裂位置处在一个对称结构的中心，产生平末5'-G↓AATTC-3'3'-CTTAA↓G-5"端，如HaelII酶切后产生5"-GG↓CC-3"3”-CC↓GG-5′。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速率取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如质粒存在3中构型：超螺旋共价闭合质粒DNA，开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂，线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂。这3种构型的质粒在凝胶电泳中的迁移率不同，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。DNA连接酶能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键，这种酶需要在一条DNA链的3-末端具有一个游离的羟基（-OH)，和在另一条DNA链的5"-末端具有一个磷酸基团（~P）。4
4 准备（周一，约半天） 实验一 DNA 重组（周二，1 天） 一、实验目的 学习使用限制性内切酶及 DNA 连接酶进行 DNA 酶切、重组的原理和方法，同时学习琼脂糖凝 胶电泳检测和纯化 DNA 的方法和技术。 二、实验原理 迄今已发现了 3000 多种限制性内切酶。传统上将限制性内切酶按照亚基组成、酶切位置、识别 位点、辅助因子等因素划分为三大类。II 型酶在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开 DNA 链。它们产生确定的限制片段，因此是三类限制性内切酶中唯一用于 DNA 分析和克隆的一类。 II 型限制性内切酶中最普遍的如 EcoR I、Hind III、BamHI 和 Not I 这样在识别序列中进行切割 的酶。这一类酶是构成商业化酶的主要部分。大部分这类酶都以同二聚体的形式结合到 DNA 上，因 而识别的是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到 DNA 上，识别非对称序列。一些酶识别连续 的序列（如 EcoR I 识别 GAATTC；HindIII 识别 AAGCTT; BamHI 识别 G↓GATCC; Not I 识别 GC↓GGCCGC）；而另一些识别不连续的序列（如 Bgl I 识别 GCCNNNNNGGC）。限制性内切酶酶切 DNA 后形成两种类型的末端：(i) 两条链断裂的位置是交错地，产生粘性末端，如 EcoR I 酶切后产 生 末端；(ii) 两条链的断裂位置处在一个对称结构的中心，产生平末 端，如 HaeIII 酶切后产生 DNA分子在琼脂糖 凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。 DNA分子在高于等电点的 pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上 的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移 动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速率取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构 型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与 相对分子量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子量的DNA，也可以分离相对分 子质量相同，但构型不同的DNA分子。如质粒存在3中构型：超螺旋共价闭合质粒DNA，开环质粒 DNA，即共价闭合环状质粒DNA 1条链断裂，线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 2条链发生 断裂。这3种构型的质粒在凝胶电泳中的迁移率不同，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状 DNA，最慢的为开环质粒DNA。 DNA连接酶能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键，这种酶需要在一条DNA链的3’-末端 具有一个游离的羟基（-OH），和在另一条DNA链的5’-末端具有一个磷酸基团（~ P）。 5’-G↓AATTC-3’ 3’-CTTAA↓G-5’ 5’-GG↓CC-3’ 3’-CC↓GG-5’
ligas53在本实验3'5中，采用BamHI和NotI两种限制酶将EGFP基因从真核表达质粒pEGFP-N3中切割下来（双酶切反应），同时对原核表达载体pET32a质粒也进行同样的双酶切反应，产生具有相同酶切末端的质粒片段。电泳分析(分离)后，将酶切产生的EGFP基因片段和pET32a质粒片段分别进行纯化回收，并由T4DNA连接酶进行连接，获得含pET32aEGFP重组原核表达质粒的连接产物，用于转化大肠杆菌克隆菌株DH5α来进行阳性克隆的筛选。三、实验材料、仪器及试剂3.1实验材料pEGFP-N3质粒，pET-32a质粒3.2仪器准备微波炉、水浴锅、恒温摇床、移液器、电泳槽、电泳仪、制冰机、紫外透射仪3.3试剂1.BamHI酶（碧云天，D6053）2.NotI酶（碧云天，D6497）3.50×TAE电泳缓冲液4.10x凝胶电泳上样缓冲液5.琼脂糖6.DNA荧光染料7.DNA凝胶回收试剂盒8.T4-DNA连接酶及连接缓冲液（碧云天，D7006）四、操作步骤（一）酶切1.在灭菌的EP管中，建立如下双酶切反应体系（20μuL）：反应物（uL）pEGFP-N3体系pET-32a体系质粒<1 μg pEGFP-N3<1μgpET32a2 μL10xbufferO2 μL灭菌水xμLxμLBamHI1 μL1 μLNot I1 μL1 μL
5 在本实验 中，采用 BamH I 和 Not I 两种限制酶将EGFP基因从真核表达质粒pEGFP-N3中切割下来（双酶切反应），同 时对原核表达载体pET32a质粒也进行同样的双酶切反应，产生具有相同酶切末端的质粒片段。电泳 分析(分离)后，将酶切产生的EGFP基因片段和pET32a质粒片段分别进行纯化回收，并由T4 DNA连 接酶进行连接，获得含pET32a_EGFP重组原核表达质粒的连接产物，用于转化大肠杆菌克隆菌株 DH5α来进行阳性克隆的筛选。 三、实验材料、仪器及试剂 3.1 实验材料 pEGFP-N3质粒，pET-32a 质粒 3.2 仪器准备 微波炉、水浴锅、恒温摇床、移液器、电泳槽、电泳仪、制冰机、紫外透射仪 3.3 试剂 1．BamH I 酶（碧云天，D6053） 2．Not I 酶（碧云天，D6497） 3．50 ×TAE 电泳缓冲液 4．10×凝胶电泳上样缓冲液 5．琼脂糖 6．DNA荧光染料 7．DNA凝胶回收试剂盒 8．T4-DNA连接酶及连接缓冲液（碧云天，D7006） 四、操作步骤 （一） 酶切 1． 在灭菌的EP管中，建立如下双酶切反应体系（20 μL）： 反应物（μL） pEGFP-N3 体系 pET-32a 体系 质粒 <1 μg pEGFP-N3 <1 μg pET32a 10×buffer O 2 μL 2 μL 灭菌水 x μL x μL BamH I 1 μL 1 μL Not I 1 μL 1 μL ligas 5’ e 3’ 5’ 3’