厦门大学：化学工程与生物工程系生物工程专业实验指导书（共十个实验）

专业实验指导书(生物工程)厦门大学化学工程与生物工程系2011年7月

专业实验指导书 (生物工程) 厦门大学化学工程与生物工程系 2011 年 7 月

目录实验一重组大肠杆菌产L-色氨酸的补料-分批发酵实验二发酵液中L-色氨酸的提取纯化实验三L-色氨酸含量和纯度的测定实验四质粒DNA的提取实验11实验五聚合酶链式反应体外扩增DNA.-14实验六琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定质粒DNA..19实验七大肠杆菌的DNA转化实验22-实验八厌氧细菌丁酸梭菌的培养24.实验九碱性磷酸酶的酶促反应动力学实验28.实验十荧光显微镜检测大肠杆菌基因工程菌死活细胞-32

I 目 录 实验一 重组大肠杆菌产 L-色氨酸的补料-分批发酵.- 1 - 实验二 发酵液中 L-色氨酸的提取纯化 .- 4 - 实验三 L-色氨酸含量和纯度的测定 .- 7 - 实验四 质粒 DNA 的提取实验.- 11 - 实验五 聚合酶链式反应体外扩增 DNA.- 14 - 实验六 琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定质粒 DNA.- 19 - 实验七 大肠杆菌的 DNA 转化实验.- 22 - 实验八 厌氧细菌丁酸梭菌的培养 .- 24 - 实验九 碱性磷酸酶的酶促反应动力学实验 .- 28 - 实验十 荧光显微镜检测大肠杆菌基因工程菌死活细胞 .- 32 -

实验一重组大肠杆菌产L-色氨酸的补料-分批发酵一、实验目的1.通过对L-色氨酸的发酵，了解L-色氨酸的补料-分批发酵的基本过程；2.初步掌握微生物发酵的基本操作。二、概述和原理L-色氨酸（L-Trp）是含有吲哚的中性芳香族氨基酸，是人和动物生命活动中不可缺少的必需氨基酸之一。L-色氨酸不仅在营养代谢中起重要作用，而且还广泛应用于医药、食品、饲料等方面[1-2]，随着市场需求量的日益增加，L-色氨酸具有广阔的应用前景。早期的L-色氨酸的生产方法主要依靠化学合成法和蛋白质水解法，但是由于这些方法存在着材料来源有限、周期长、工艺复杂、产品成分复杂等缺点，因而在上世纪90年代逐渐被淘汰，随着对微生物法生产L-色氨酸研究的不断深入，微生物法已经走向实用并且处于主导地位，微生物发酵法具有产酸高、成本低、质量好等优势，将是未来大规模生产L-色氨酸的首选技术。该法主要是以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉价原料为碳源，利用优良的L-色氨酸生产菌种来生产L-色氨酸。补料-分批发酵，是指在分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养成分的一种发酵方法，现已经广泛应用于发酵工业。流加操作的主要特点就是能够调节微生物生长反应环境中营养物质的浓度，可以避免营养成分的初始浓度过高而出现的底物抑制现象，同时也能阻正某些限制性营养成分由于在反应过程中被耗尽而影响微生物的生长和产物的形成。在发酵生产L-色氨酸过程中，菌体主要以葡萄糖为碳源，由于在高浓度的葡萄糖条件下，大肠杆菌容易产生乙酸，而当发酵液中乙酸浓度积累到2g/L时，菌体将停止生长并且抑制外源基因的表达3]。因此本实验需采用补料-分批发酵的方式。补料培养基加入形式可以分为非反馈补料和反馈补料，非反馈补料主要包括恒速补料、指数补料、逐级提速流加等几种流加形式，而反馈补料根据所选反馈指标的不同可分为恒pH值法、恒溶解氧法、菌体浓度反馈、CER法、DO-stat法等几种补料方法。反馈补料由于能够根据反馈的信息及时调整补料的速率和策略，从而能够很好地控制系统-1-

- 1 - 实验一 重组大肠杆菌产 L-色氨酸的补料-分批发酵 一、 实验目的 1. 通过对 L-色氨酸的发酵，了解 L-色氨酸的补料-分批发酵的基本过程； 2. 初步掌握微生物发酵的基本操作。 二、 概述和原理 L-色氨酸（L-Trp）是含有吲哚的中性芳香族氨基酸，是人和动物生命活动中不可缺 少的必需氨基酸之一。L-色氨酸不仅在营养代谢中起重要作用，而且还广泛应用于医药、 食品、饲料等方面[1-2]，随着市场需求量的日益增加，L-色氨酸具有广阔的应用前景。 早期的 L-色氨酸的生产方法主要依靠化学合成法和蛋白质水解法，但是由于这些方 法存在着材料来源有限、周期长、工艺复杂、产品成分复杂等缺点，因而在上世纪 90 年代逐渐被淘汰，随着对微生物法生产 L-色氨酸研究的不断深入，微生物法已经走向实 用并且处于主导地位，微生物发酵法具有产酸高、成本低、质量好等优势，将是未来大 规模生产 L-色氨酸的首选技术。该法主要是以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉价原料为碳源，利 用优良的 L-色氨酸生产菌种来生产 L-色氨酸。 补料-分批发酵，是指在分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养成分的一种发 酵方法，现已经广泛应用于发酵工业。流加操作的主要特点就是能够调节微生物生长反 应环境中营养物质的浓度，可以避免营养成分的初始浓度过高而出现的底物抑制现象， 同时也能阻止某些限制性营养成分由于在反应过程中被耗尽而影响微生物的生长和产物 的形成。在发酵生产 L-色氨酸过程中，菌体主要以葡萄糖为碳源，由于在高浓度的葡萄 糖条件下，大肠杆菌容易产生乙酸，而当发酵液中乙酸浓度积累到 2 g/L 时，菌体将停 止生长并且抑制外源基因的表达[3]。因此本实验需采用补料-分批发酵的方式。 补料培养基加入形式可以分为非反馈补料和反馈补料，非反馈补料主要包括恒速补 料、指数补料、逐级提速流加等几种流加形式，而反馈补料根据所选反馈指标的不同可 分为恒 pH 值法、恒溶解氧法、菌体浓度反馈、CER 法、DO-stat 法等几种补料方法。反 馈补料由于能够根据反馈的信息及时调整补料的速率和策略，从而能够很好地控制系统

的营养浓度，防止营养浓度过高，故在大肠杆菌培养中常被广泛采用4]。本实验主要采用溶氧反馈流加葡萄糖的方式，即当发酵液中葡萄糖耗尽时，溶氧值表现为上升，开始流加葡萄糖；当溶氧值降低时，停止流加葡萄糖。通过溶氧反馈补料能够很好的控制发酵液中葡萄糖的浓度，从而实现L-色氨酸的高效表达。本实验以重组大肠杆菌为菌种，进行L-色氨酸补料-分批发酵，并测定发酵液中L-色氨酸的含量。三、实验材料、试剂与仪器1.菌种重组大肠杆菌K12W3110。2.培养基（1）摇瓶种子培养基：K2HPO42.0%，酵母粉2.0%，KH2PO41.0%，葡萄糖3.0%MgSO4-7H2O0.1%，pH7.4;（2）发酵罐培养基：K,HPO40.5%，酵母粉0.2%，MgSO47H2O0.1%，(NH4)SO40.1%，柠檬酸0.3%，FeSO4·7H200.005%，葡萄糖0.8%；（3）摇瓶种子培养基为300mL三角瓶装培养基50mL；流加葡萄糖浓度为600g/L；以上培养基均于0.1MPa下灭菌20min，其中葡萄糖单消后加入。3.仪器紫外-可见分光光度计，往复式恒温摇床，离心机，pH计，灭菌锅，显微镜，四、实验操作步骤1．摇瓶种子培养打开冷冻甘油管，取500μL的菌液加入种子摇瓶中，摇瓶于37℃、200rpm摇床中培养10~12h，取样测定菌体浓度，使得最终OD660值为6～7。2.发酵罐培养以10%的接种量将培养好的种子培养液接入发酵罐中，发酵罐装液量50%，pH用25%氨水控制在6.5，温度35℃，搅拌速度900rpm，溶氧自动显示，空气流量2VVM，培养时间36h。当初糖耗尽溶氧表现为突然上升时，设定合适的流加泵补料周期（如设-2-

- 2 - 的营养浓度，防止营养浓度过高，故在大肠杆菌培养中常被广泛采用[4]。本实验主要采 用溶氧反馈流加葡萄糖的方式，即当发酵液中葡萄糖耗尽时，溶氧值表现为上升，开始 流加葡萄糖；当溶氧值降低时，停止流加葡萄糖。通过溶氧反馈补料能够很好的控制发 酵液中葡萄糖的浓度，从而实现 L-色氨酸的高效表达。 本实验以重组大肠杆菌为菌种，进行 L-色氨酸补料-分批发酵，并测定发酵液中 L- 色氨酸的含量。 三、 实验材料、试剂与仪器 1. 菌种 重组大肠杆菌 K12 W3110。 2. 培养基 （1）摇瓶种子培养基：K2HPO4 2.0%，酵母粉 2.0%，KH2PO4 1.0%，葡萄糖 3.0%， MgSO4·7H2O 0.1%，pH7.4； （2）发酵罐培养基：K2HPO4 0.5%，酵母粉 0.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，(NH4)2SO4 0.1%，柠檬酸 0.3%，FeSO4·7H2O 0.005%，葡萄糖 0.8%； （3）摇瓶种子培养基为 300 mL 三角瓶装培养基 50 mL；流加葡萄糖浓度为 600 g/L； 以上培养基均于 0.1 MPa 下灭菌 20 min，其中葡萄糖单消后加入。 3. 仪器 紫外-可见分光光度计，往复式恒温摇床，离心机，pH 计，灭菌锅，显微镜。 四、 实验操作步骤 1. 摇瓶种子培养 打开冷冻甘油管，取 500 L 的菌液加入种子摇瓶中，摇瓶于 37 ℃、200 rpm 摇床中 培养 10～12 h，取样测定菌体浓度，使得最终 OD660 值为 6～7。 2. 发酵罐培养 以 10%的接种量将培养好的种子培养液接入发酵罐中，发酵罐装液量 50%， pH 用 25%氨水控制在 6.5，温度 35 ℃，搅拌速度 900 rpm，溶氧自动显示，空气流量 2 VVM， 培养时间 36 h。当初糖耗尽溶氧表现为突然上升时，设定合适的流加泵补料周期（如设

定流加周期10s：工作2s，停8s），使得溶氧值处于上下波动状态。每隔4h从发酵罐中取样，在紫外-可见分光光度计上测定发酵液660nm处的光密度值A(OD660)，在pH计上测定pH值，记录溶氧值。3.无菌体发酵液的制备（实验三备用）取1mL发酵液加入离心管，10000rpm离心5min，取上清，将上清液稀释100倍后，4℃冰箱保存。五、实验结果及其处理根据不同发酵时间发酵液的OD660、DO、pH和L-色氨酸产量(此值实验三测得)，绘制菌体的生长曲线。六、思考题1．微生物发酵罐发酵有哪几种方法？发酵罐发酵主要检测哪几种指标？2.工业发酵罐常用何种灭菌方式？七、参考文献[1]陈涛，陈宁.L-色氨酸的生产及其代谢控制育种)[]生物科技通讯,2000,2:141-145[2] Leuchtenberger W, Huthmacher K, Drauz K.Biotechnological production of amino acids andderivatives: current status and prospects []. Appl Microbiol Biotechnol, 2005, 69(1): 1-8.[3] Shiloach J, Fass R. Growing E. coli to high cell density—A historical perspective on methoddevelopment[JJ.Biotechnology Advances, 2005, 23(5): 345-357[4] Yuan H, Yang X, Hua Z C. Optimization of expression of anannexin V-hirudin chimeric protein inEscherichia coli[J].Microbiological Research, 2004, 159(2): 147-156-3

- 3 - 定流加周期 10 s：工作 2 s，停 8 s），使得溶氧值处于上下波动状态。每隔 4 h 从发酵罐 中取样，在紫外-可见分光光度计上测定发酵液 660 nm 处的光密度值 A(OD660)，在 pH 计上测定 pH 值，记录溶氧值。 3. 无菌体发酵液的制备(实验三备用) 取 1 mL 发酵液加入离心管，10000 rpm 离心 5 min，取上清，将上清液稀释 100 倍 后，4 ℃冰箱保存。 五、 实验结果及其处理 根据不同发酵时间发酵液的 OD660、DO、pH 和 L-色氨酸产量(此值实验三测得)，绘 制菌体的生长曲线。 六、 思考题 1. 微生物发酵罐发酵有哪几种方法？发酵罐发酵主要检测哪几种指标？ 2. 工业发酵罐常用何种灭菌方式？ 七、 参考文献 [1] 陈涛, 陈宁. L-色氨酸的生产及其代谢控制育种)[J]. 生物科技通讯, 2000, 2: 141-145. [2] Leuchtenberger W, Huthmacher K, Drauz K. Biotechnological production of amino acids and derivatives: current status and prospects [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2005, 69(1): 1-8. [3] Shiloach J, Fass R. Growing E. coli to high cell density—A historical perspective on method development[J]. Biotechnology Advances, 2005, 23(5): 345-357. [4] Yuan H, Yang X, Hua Z C. Optimization of expression of anannexin V-hirudin chimeric protein in Escherichia coli[J]. Microbiological Research, 2004, 159(2): 147-156