色谱柱：Sunfire-C18（4.6×250mm,Agilent1200SeriesLNMP055203)；流速：1mL/min；检测波长：278nm；温度：36℃。3.标准样品的制备精密称取25mgL-色氨酸标准品，用纯水定容于25mL棕色容量瓶中，制得浓度为1g/L的L-色氨酸标准储备液，于4℃冰箱保存备用。精密移取适量上述标准储备液，用纯水配制成浓度为10、20、40、60、80、100mg/L的L-色氨酸标准品溶液。使用前须用0.22um一次性针头过滤器过滤。4.L-色氨酸标准曲线的测定根据上文所述的色谱条件，将上述不同浓度的L-色氨酸标准液进行HPLC测定，并以浓度为横坐标，相对应的峰面积为纵坐标，制作L-色氨酸标准曲线。5.L-色氨酸结晶样品的处理准确称取25mgL-色氨酸结晶样品，用纯水定容于250mL棕色容量瓶中，制得浓度为100mg/L，用0.22μm一次性针头过滤器过滤，滤液用于HPLC测定。6.结晶样品纯度的测定在与标准品相同的色谱条件下进行样品测定，根据保留时间确定样品中的L-色氨酸，再将结晶样品峰的峰面积对照标准曲线可得到结晶样品中的L-色氨酸含量，从而计算L-色氨酸结晶纯度。六、实验结果及其处理1．绘制L-色氨酸标准曲线。2.计算发酵液样品中L-色氨酸含量。3.L-色氨酸含量=标准曲线查得L-色氨酸浓度×稀释倍数4.计算L-色氨酸结晶的纯度。结晶中L一色氨酸含量（mg/L）L-色氨酸结晶纯度=X100%100(mg/L)-9-
- 9 - 色谱柱：Sunfire-C18（4.6×250 mm, Agilent 1200 Series LN MP055203）； 流速：1 mL/min； 检测波长：278 nm； 温度：36 ℃。 3. 标准样品的制备 精密称取 25 mg L-色氨酸标准品，用纯水定容于 25 mL 棕色容量瓶中，制得浓度为 1 g/L 的 L-色氨酸标准储备液，于 4 ℃冰箱保存备用。精密移取适量上述标准储备液， 用纯水配制成浓度为 10、20、40、60、80、100 mg/L 的 L-色氨酸标准品溶液。使用前 须用 0.22 μm 一次性针头过滤器过滤。 4. L-色氨酸标准曲线的测定 根据上文所述的色谱条件，将上述不同浓度的 L-色氨酸标准液进行 HPLC 测定，并 以浓度为横坐标，相对应的峰面积为纵坐标，制作 L-色氨酸标准曲线。 5. L-色氨酸结晶样品的处理 准确称取 25 mg L-色氨酸结晶样品，用纯水定容于 250 mL 棕色容量瓶中，制得浓度 为 100 mg/L，用 0.22 μm 一次性针头过滤器过滤，滤液用于 HPLC 测定。 6. 结晶样品纯度的测定 在与标准品相同的色谱条件下进行样品测定，根据保留时间确定样品中的 L-色氨酸， 再将结晶样品峰的峰面积对照标准曲线可得到结晶样品中的 L-色氨酸含量，从而计算 L-色氨酸结晶纯度。 六、 实验结果及其处理 1. 绘制 L-色氨酸标准曲线。 2. 计算发酵液样品中 L-色氨酸含量。 3. L-色氨酸含量 = 标准曲线查得 L-色氨酸浓度 × 稀释倍数 4. 计算 L-色氨酸结晶的纯度
七、思考题测定L-色氨酸时，分光光度法相对于其他测定方法有何优缺点？-10-
- 10 - 七、 思考题 测定 L-色氨酸时，分光光度法相对于其他测定方法有何优缺点？
实验四质粒DNA的提取实验目的要求一、1．了解并掌握质粒DNA的提取方法。二、概述和原理质粒（pLasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1~200kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增：收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁裂解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中，用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。三、实验材料、试剂与仪器1.仪器和材料1mL移液枪，200μL移液枪，20μL移液枪，台式高速离心机（15000r/min）二台，基因工程菌。2.试剂碱裂解溶液I:50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA-Naz（pH8.0），25mmol/LTris-HCl（pH8.0），灭菌后4℃保存。碱裂解溶液II：0.2mol/LNaOH，SDS浓度为1%，现用现配置，室温下使用。碱裂解溶液IIl：pH4.8乙酸钾溶液（60mL的5mol/LKAc，11.5mL冰醋酸，28.5mLH,O），灭菌后4℃保存。该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L。用-11-
- 11 - 实验四 质粒 DNA 的提取实验 一、 目的要求 1. 了解并掌握质粒 DNA 的提取方法。 二、 概述和原理 质粒（pLasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在 1~200 kb 之间，具有双 链闭合环状结构的 DNA 分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主 复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它 可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主细胞就不能存活，而 它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 所有分离质粒 DNA 的方法都包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解 细菌；分离和纯化质粒 DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS） 可使细胞壁裂解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色 DNA 缠绕附着在 细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒 DNA 则留在上清液中，用乙醇沉淀、洗 涤，可得到质粒 DNA。 三、 实验材料、试剂与仪器 1. 仪器和材料 1 mL 移液枪，200 µL 移液枪，20 µL 移液枪，台式高速离心机（15000 r/min）二台， 基因工程菌。 2. 试剂 碱裂解溶液 I：50 mmol/L 葡萄糖，10 mmol/L EDTA-Na2（pH 8.0），25 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0），灭菌后 4 ℃保存。 碱裂解溶液 II：0.2 mol/L NaOH，SDS 浓度为 1 %，现用现配置，室温下使用。 碱裂解溶液 III：pH 4.8 乙酸钾溶液（60 mL 的 5 mol/L KAc，11.5 mL 冰醋酸，28.5 mL H2O），灭菌后 4 ℃保存。该溶液钾离子浓度为 3 mol/L，醋酸根离子浓度为 5 mol/L。用