实验三蛋白质等电点测定一、目的了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。二、原理蛋白质的分子量很大，它能形成稳定均一的溶液，主要是由于蛋白质分子都带有相同符号的电荷，同时蛋白质分子周围有一层溶剂化的水膜，避免蛋白质分子之间聚集而沉降。蛋白质分子所带的电荷与溶液的pH值有很大关系，蛋白质是两性电解质，在酸性溶液中成阳离子，在碱性溶液中成阴离子。蛋白质分子所带净电荷为零时的pH值称为蛋白质的等电点（pl)。在等电点时，蛋白质分子在电场中不向任何一极移动，而且分子与分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加，所以这时可以使蛋白质溶液的粘度、渗透压均减到最低，且溶液变混浊。若再加入一定量的溶剂如乙醇、丙酮，它们与蛋白质分子争夺水分子，竭力减低蛋白质水化层的厚度而使混浊更加明显。各种蛋白质的等电点都不相同，但偏酸性的较多，如牛乳中的酪蛋白的等电点是4.7~4.8，血红蛋白等电点为6.7~6.8，胰岛素是5.3~5.4，鱼精蛋白是一个典型的碱性蛋白，其等电点在pH12.0~12.4。近年来蛋白质的等电点可以采用等电聚焦技术加以准确测定，但需一定的实验条件。本实验采用蛋白质在不同pH溶液中形成的混浊度来确定，即混浊度最大时的pH值即为该种蛋白质的等电点值，这个方法虽然不很准确，但在一般实验条件下都能进行，操作也简便。三、器材及试剂1.器材：试管、吸管、移液管、量筒、500mL容量瓶、试管架2．试剂：（1）0.01mol/L醋酸溶液（2）0.1mol/L醋酸溶液（3）1mol/L醋酸溶液（4）1mol/L氧化钠溶液（氢氧化钠和醋酸溶液的浓度要标定）（5）酪蛋白四、操作步骤1.制备蛋白质胶液（1）称取酪蛋白3克，放在烧杯中，加入50mL40℃的蒸馏水。（2）加入50毫升1mol/L氢氧化钠溶液，微热搅拌直到蛋白质完全溶解为止。（3）在烧杯中再加入1mol/L醋酸溶液50mL，摇匀，使蛋白质完全溶解为止。9
9 实验三 蛋白质等电点测定 一、目的 了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。 二、原理 蛋白质的分子量很大，它能形成稳定均一的溶液，主要是由于蛋白质分子都带有相同符号的电 荷，同时蛋白质分子周围有一层溶剂化的水膜，避免蛋白质分子之间聚集而沉降。 蛋白质分子所带的电荷与溶液的 pH 值有很大关系，蛋白质是两性电解质，在酸性溶液中成阳 离子，在碱性溶液中成阴离子。蛋白质分子所带净电荷为零时的 pH 值称为蛋白质的等电点（pI）。 在等电点时，蛋白质分子在电场中不向任何一极移动，而且分子与分子间因碰撞而引起聚沉的倾向 增加，所以这时可以使蛋白质溶液的粘度、渗透压均减到最低，且溶液变混浊。若再加入一定量的 溶剂如乙醇、丙酮，它们与蛋白质分子争夺水分子，竭力减低蛋白质水化层的厚度而使混浊更加明 显。各种蛋白质的等电点都不相同，但偏酸性的较多，如牛乳中的酪蛋白的等电点是 4.7~4.8，血红 蛋白等电点为 6.7~6.8，胰岛素是 5.3~5.4，鱼精蛋白是一个典型的碱性蛋白，其等电点在 pH12.0~12.4。 近年来蛋白质的等电点可以采用等电聚焦技术加以准确测定，但需一定的实验条件。本实验采用蛋 白质在不同 pH 溶液中形成的混浊度来确定，即混浊度最大时的 pH 值即为该种蛋白质的等电点值， 这个方法虽然不很准确，但在一般实验条件下都能进行，操作也简便。 三、器材及试剂 1．器材： 试管、吸管、移液管、量筒、500mL 容量瓶、试管架 2．试剂： （1）0.01 mol/L 醋酸溶液 （2）0.1 mol/L 醋酸溶液 （3）1 mol/L 醋酸溶液 （4）1 mol/L 氧化钠溶液（氢氧化钠和醋酸溶液的浓度要标定） （5）酪蛋白 四、操作步骤 1．制备蛋白质胶液 （1）称取酪蛋白 3 克，放在烧杯中，加入 50 mL 40℃的蒸馏水。 （2）加入 50 毫升 1 mol/L 氢氧化钠溶液，微热搅拌直到蛋白质完全溶解为止。 （3）在烧杯中再加入 1 mol/L 醋酸溶液 50 mL，摇匀，使蛋白质完全溶解为止
（4）将溶解好的蛋白溶液转移到500mL容量瓶中，并用少量蒸馏水洗净烧杯，一并倒入容量瓶加入蒸馏水定容至500mL，得到略现浑浊的、在0.1mol/LNaAC溶液中的酪蛋白胶体。2.等电点测定按下表顺序在各管中加入蛋白质胶液，并准确地加入蒸馏水和各种浓度的醋酸溶液，加入后立即摇匀。察观蛋白质0.1 mol/L0.01mol/L1 mol/L管H,0HACHACHACpH01020胶液号(mL)(mL)(mL)(mL)分钟分钟分钟(mL)114.380.625.8一213.751.255.5314.750.255.2144.500.504.9514.001.004.6613.002.004.3711.004.004.01814.200.803.7913.401.603.4观察各管产生的混浊并根据混浊度来判断酪蛋白的等电点。观察时可用+，++，+++，表示浑浊度。五、思考题（1）在等电点时蛋白质的溶解度为什么最低？请结合你的实验结果和蛋白质的胶体性质加以说明。（2）在分离蛋白质时等电点有何实际应用意义？10
10 （4）将溶解好的蛋白溶液转移到 500 mL 容量瓶中，并用少量蒸馏水洗净烧杯，一并倒入容量瓶。 加入蒸馏水定容至 500 mL，得到略现浑浊的、在 0.1 mol/L NaAC 溶液中的酪蛋白胶体。 2．等电点测定 按下表顺序在各管中加入蛋白质胶液，并准确地加入蒸馏水和各种浓度的醋酸溶液，加入后立 即摇匀。 管 号 蛋白质 胶液 (mL) H2O (mL) 0.01 mol/L HAC (mL) 0.1 mol/L HAC （mL） 1 mol/L HAC （mL） pH 观 察 0 分钟 10 分钟 20 分钟 1 1 4.38 0.62 － － 5.8 2 1 3.75 1.25 － － 5.5 3 1 4.75 － 0.25 － 5.2 4 1 4.50 － 0.50 － 4.9 5 1 4.00 － 1.00 － 4.6 6 1 3.00 － 2.00 － 4.3 7 1 1.00 － 4.00 － 4.0 8 1 4.20 － － 0.80 3.7 9 1 3.40 － － 1.60 3.4 观察各管产生的混浊并根据混浊度来判断酪蛋白的等电点。观察时可用+，++，+++，表示浑浊度。 五、思考题 （1）在等电点时蛋白质的溶解度为什么最低？请结合你的实验结果和蛋白质的胶体性质加以说明。 （2）在分离蛋白质时等电点有何实际应用意义？
实验四酪蛋白的制备一、目的要求1、掌握从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。2、了解等电点沉淀在蛋白质制备中的应用。二、原理牛奶含有半乳糖、蛋白质、脂肪成份。蛋白质中的酪蛋白通过等电点沉淀，再通过离心而获得糖类小分子由于处于清液中而分离，沉淀物中所含的脂肪通过有机溶剂抽提而去除，最终得到纯白色、晶状酪蛋白。三、试剂与器材材料：牛奶（奶粉配制，3%）试剂：0.2mol/LHAc-NaAc缓冲液、95%乙醇、乙醚器材：离心机、水浴锅、pH计四、操作方法1.取10mL40℃牛奶预热，加入40℃预热的醋酸缓冲液10mL左右，边加边搅拌，调pH至4.7，室温冷却，5000r/min离心5min，得到沉淀。2.沉淀于离心管内加入4mLH20悬浮，5000r/min离心5min，得到沉淀。3.沉淀于离心管内加入20mL乙醇，放置5min，微搅动，去脂肪。4.漏斗过滤（或5000r/min离心5min)上述悬浮液，在漏斗中加入20mL乙醇悬浮沉淀，滤干（或5000r/min离心5min)。5.加入20mL乙醇乙醚混合液（1:1）洗涤，漏斗过滤（或5000r/min离心5min），后再加入20mL乙醚洗涤脂肪完毕，漏斗过滤。6.于60℃，带滤纸烘干4h，称重并计算得率。五、计算酪蛋白质量（g）X100%实际获得百分率=10mL牛奶六、注意事项1、牛奶与缓冲液要预热2、缓冲液要缓加缓搅11
11 实验四 酪蛋白的制备 一、目的要求 1、掌握从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。 2、了解等电点沉淀在蛋白质制备中的应用。 二、原理 牛奶含有半乳糖、蛋白质、脂肪成份。蛋白质中的酪蛋白通过等电点沉淀，再通过离心而获得， 糖类小分子由于处于清液中而分离，沉淀物中所含的脂肪通过有机溶剂抽提而去除，最终得到纯白 色、晶状酪蛋白。 三、试剂与器材 材料：牛奶（奶粉配制，3％） 试剂：0.2 mol/L HAc-NaAc 缓冲液、95%乙醇、乙醚 器材：离心机、水浴锅、pH 计 四、操作方法 1. 取 10mL40°C 牛奶预热，加入 40°C 预热的醋酸缓冲液 10mL 左右，边加边搅拌，调 pH 至 4.7， 室温冷却，5000r/min 离心 5min，得到沉淀。 2. 沉淀于离心管内加入 4mL H2O 悬浮，5000r/min 离心 5min，得到沉淀。 3. 沉淀于离心管内加入 20mL 乙醇，放置 5min，微搅动，去脂肪。 4. 漏斗过滤(或 5000r/min 离心 5min)上述悬浮液，在漏斗中加入 20mL 乙醇悬浮沉淀，滤干(或 5000r/min 离心 5min)。 5. 加入 20mL 乙醇乙醚混合液（1:1）洗涤，漏斗过滤(或 5000r/min 离心 5min)，后再加入 20mL 乙 醚洗涤脂肪完毕，漏斗过滤。 6. 于 60°C，带滤纸烘干 4h，称重并计算得率。 五、计算 六、注意事项 1、牛奶与缓冲液要预热 2、缓冲液要缓加缓搅 酪蛋白质量（g） 10 mL 牛奶 实际获得百分率＝ × 100％
3、在滤纸上样品的脱脂过程要搅动，不得破损滤纸4、实验环境要保持空气流通，门窗要开七、思考题(1)在酪蛋白制备时为什么要用醋酸缓冲液调pH到4.8？(2)乙醚、乙醇作用是什么？12
12 3、在滤纸上样品的脱脂过程要搅动，不得破损滤纸 4、实验环境要保持空气流通，门窗要开 七、思考题 (1)在酪蛋白制备时为什么要用醋酸缓冲液调 pH 到 4.8？ (2)乙醚、乙醇作用是什么？
实验五氨基酸的分离鉴定一纸层析法一、目的通过对氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。二、原理层析法又称色谱法。1903年，科学家发现用挥发油冲洗菊粉柱时，可将叶子的色素分成许多颜色的层圈。此后，把这种利用有色物质在吸附剂上因吸附能力不同而得到分离的方法称为色谱法（Chromatography）。虽然后来将色谱法应用于无色物质分离，但是这个名字一直沿用下来。层析法除了吸附层析以外，还有离子交换层析和分配层析。一般认为纸层析是分配层析中的一种，但也并存着吸附和离子交换作用。分配层析是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得到分离的。通常用α表示分配系数。溶质在固定相的浓度(Cs）α=溶质在流动相的浓度(C2)一个物质在某溶剂系统中的分配系数，在一定的温度下是一个常数。纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的OH基具有亲水性，因此能吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。有机溶剂自上而下流动，称为下行层析；自下而上流动，称为上行层析。流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使物质在两相之间不断分配而得到分离。纸层析的实际操作是在滤纸的一端（通常距纸边缘2厘米），点上样品，于后，在密闭的容器内待纸饱和了适当的溶剂蒸气后，令溶剂从有样品的一端经过毛细管的作用，流向另一端，使样品中的混合物得到分离。这种操作常称单向层析。为了得到更好的分离，还可以作双向操作或称双向层析。即在滤纸的一角上点样品，先用一种溶剂系统展层后，使滤纸干燥，将纸调转90°，再用另一个溶剂系统展层。物质分离后，层析点在图谱上的位置，即在纸上的移动速率，用R表示。原点到层析点中心的距离RF原点到溶剂前沿的距离若X表示原点到层析点中心的距离。X+Y表示原点到溶剂前沿的距离，则XRfX+YR，值的主要决定因素是分配系数（α)。对于某一物质在一定条件下的α值是固定的。因此R1
13 实验五 氨基酸的分离鉴定－纸层析法 一、目的 通过对氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。 二、原理 层析法又称色谱法。1903 年，科学家发现用挥发油冲洗菊粉柱时，可将叶子的色素分成许多颜 色的层圈。此后，把这种利用有色物质在吸附剂上因吸附能力不同而得到分离的方法称为色谱法 （Chromatography）。虽然后来将色谱法应用于无色物质分离，但是这个名字一直沿用下来。 层析法除了吸附层析以外，还有离子交换层析和分配层析。一般认为纸层析是分配层析中的一 种，但也并存着吸附和离子交换作用。 分配层析是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得到分离的。通常用 α 表示分配系数。 α= L S C C 溶质在流动相的浓度 溶质在固定相的浓度 一个物质在某溶剂系统中的分配系数，在一定的温度下是一个常数。 纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的 OH 基具有亲水性，因此能吸附一 层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。有机溶剂自上而下流动，称为下行层析；自下而 上流动，称为上行层析。流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使物质在两相之间不断分配 而得到分离。 纸层析的实际操作是在滤纸的一端（通常距纸边缘 2 厘米），点上样品，干后，在密闭的容器内， 待纸饱和了适当的溶剂蒸气后，令溶剂从有样品的一端经过毛细管的作用，流向另一端，使样品中 的混合物得到分离。这种操作常称单向层析。为了得到更好的分离，还可以作双向操作或称双向层 析。即在滤纸的一角上点样品，先用一种溶剂系统展层后，使滤纸干燥，将纸调转 90°，再用另一个 溶剂系统展层。 物质分离后，层析点在图谱上的位置，即在纸上的移动速率，用 Rf 表示。 Rf= 原点到溶剂前沿的距离 原点到层析点中心的距离 若 X 表示原点到层析点中心的距离。X+Y 表示原点到溶剂前沿的距离，则 R f = X Y X R f 值的主要决定因素是分配系数（α）。对于某一物质在一定条件下的 α 值是固定的。因此 R f